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         云南大学云南省微生物研究所微生物资源公共平台建立于2010年,主要满足微生物物种的分类鉴定科研需要。目前配备有Biolog微生物鉴定系统(BIOLOG MicrostationTM)、高效液相色谱仪(Agilent technology 1260)、气相色谱仪(Agilent technology 7890A,并配置了MIDI全自动脂肪酸鉴定系统)、荧光微孔检测器(Molecular Devices, Spectra max Gemini XPS)、荧光定量PCR仪(Applied Biosystems, StepOnePlus)、全自动菌落分析及抑菌圈测量系统(Protocol 3)、多功能酶标仪(Molecular Devices, FlexStation3)等满足现代原核微生物分类与鉴定科研需求的所有仪器设备。同时,建立了脂肪酸气相色谱检测法、细胞呼吸醌HPLC检测法、极性脂TLC分析法、细胞壁氨基酸组分及枝菌酸TLC分析法等化学分类技术,G+C mol%含量HPLC检测法、DNA-DNA 杂交的复性速率法及膜杂交法,以及Biolog微生物鉴定系统、API细菌鉴定系统等微生物生理生化特性分类技术,自主建立了细胞壁氨基酸组分和糖组分HTLC定量分析方法、细胞呼吸醌LC-MS定量检测方法。成为国内最早能自主完成所有原核微生物分类鉴定科研需要的专业分类平台之一,对云南省微生物研究所微生物资源与分类研究方向给予了关键的技术支撑。自2010年平台建立至今,提供云南省微生物研究所300余篇SCI论文发表的鉴定技术服务。同时,在满足对内服务需求的基础上,对外承接原核微生物分类指标的检测服务。


化学分类学

呼吸醌分析 (Quinone)

样品要求:呼吸醌检测需提供至少200 mg冻干菌体。

方法:提取及纯化方法参考Collins et al. (1977),纯化的呼吸醌通过HPLC分离 (Groth et al., 1996)。通过TLC (青岛海洋化工厂,硅胶板,GF254) 法分离呼吸醌的不同类型 (如:甲基萘醌、泛醌),将这些条带从硅胶板上刮下,进行HPLC (Agilent 1260) 分析。

参考文献:

Collins MD, Pirouz T, Goodfellow M, Minnikin DE. Distribution of menaquinones in actinomycetes and corynebacteria. J Gen Microbiol 1977, 100:221–230. (DOI:10.1099/00221287-100-2-221)

Groth I, Schumann P, Weiss N, Martin K, Rainey FA. Agrococcus jenensis gen. nov., sp. nov., a new genus of actinomycetes with diaminobutyric acid in the cell wall. Int J Syst Bacteriol 1996, 46:234–239. (DOI:10.1099/00207713-46-1-234)

极性脂分析 (Polar lipids)

样品要求:极性脂检测需提供至少200 mg冻干菌体。

方法:提取及检测方法参考Minnikin et al. (1984)。取100 mg冻干菌体,在甲醇:氯仿溶液中静置分层,取下层浓缩备用。极性脂各组分的分离采用双相TLC法 (MERCK, Silica gel 60),显色剂有磷钼酸盐,钼蓝,茚三酮,α-奈酚,D-试剂 (次硝酸吡、碘化钾)。

参考文献:

Minnikin DE, O’Donnell AG, Goodfellow M, Alderson G, Athalye M et al. An integrated procedure for the extraction of bacterial isoprenoid quinones and polar lipids. J Microbiol Methods 1984, 2:233–241. (DOI:10.1016/0167-7012(84)90018-6)

脂肪酸分析 (Cellular fatty acid composition)

样品要求:脂肪酸分析需提供至少30 mg冻干菌体。

方法:脂肪酸的提取和分析参照Sherlock Microbial Identification System (MIDI Inc, Newark, USA)的操作指南完成。经过皂化、甲基化、萃取及提纯后的脂肪酸甲基酯混合物由Sherlock Microbial Identification System (MIS) (MIDI, Microbial ID, Newark, DE 19713 U.S.A.) 分离,结果由MIDI的软件包自动分析。所使用气相色谱型号为Agilent Technologies 7890A GC System;配置为Agilent气相毛细管柱 (0.2 mm x 25 m, ultra 25% Phenyl Methyl Silox);分析软件包为Sherlock Version 6.1 (Microbial Identification software package);好氧菌分析所使用的MIDI数据库为TSBA6 (MIDI database: TSBA6)

参考文献:

Technical Note #101 - Microbial Identification by Gas Chromatographic Analysis of Fatty Acid Methyl Esters (GC-FAME). (PDF)

全细胞糖分析 (Whole cell sugars)

样品要求:全细胞糖分析需提供至少20 mg冻干菌体,或培养至指数期的微生物斜面两支。

方法:分析方法参考Tang et al. (2009)。细胞水解物 (1 mol/L HCl, 100ºC, 2h) 以及糖标准品通过HPLC分离 (Agilent 1260)。糖标品包括甘露糖 (Mannose),核糖 (Ribose),鼠李糖 (Rhamnose),葡萄糖 (Glucose),半乳糖 (Galactose),木糖 (Xylose),阿拉伯糖(Arabinose)等。

参考文献:

Tang S-K, Wang Y, Chen Y, Lou K, Cao L-L et al. Zhihengliuella alba sp. nov., and emended description of the genus ZhihengliuellaInt J Syst Evol Microbiol 2009, 59:2025-2031. (DOI:10.1099/ijs.0.007344-0)

Minnikin DE, O’Donnell AG, Goodfellow M, Alderson G, Athalye M et al. An integrated procedure for the extraction of bacterial isoprenoid quinones and polar lipids. J Microbiol Methods 1984, 2:233–241. (DOI:10.1016/0167-7012(84)90018-6)

细胞壁DAP类型分析 (DAP)

样品要求:需提供至少20 mg冻干菌体,或培养至指数期的微生物斜面两支。

方法:分析方法参考Hasegawa et al. (1983)。全细胞水解物通过TLC (MERCK, cellulose plate)法进行检测分析,以鉴定DAP的不同构型 (DD-LL-meso-)。

参考文献:

Hasegawa T, Takizaea M , Tanida S. A rapid analysis for chemical grouping of aerobic actinomycetes. J Gen Appl Microbiol 1983, 29:319-322. (DOI:10.2323/jgam.29.319)

肽聚糖分析 (Peptidoglycan)

样品要求:肽聚糖分析需提供不少于4 g湿菌体。

方法:细胞壁的准备以及水解方法参考Schleifer and Kandler (1972),HPLC分析方法参考Tang et al. (2009)。HPLC型号:Agilent,1260。

参考文献:

Schleifer KH, Kandler O. Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomic implications. Bacteriol Rev 1972, 36:407-477. (PMID:4568761)

Tang S-K, Wang Y, Chen Y, Lou K, Cao L-L et al. Zhihengliuella alba sp. nov., and emended description of the genus Zhihengliuella. Int J Syst Evol Microbiol 2009, 59:2025-2031. (DOI:10.1099/ijs.0.007344-0)

枝菌酸分析 (Mycolic acid)

样品要求:枝菌酸分析需提供至少100 mg冻干菌体。

方法:分析方法参考Minnikin et al. (1980)。以石油醚提取全细胞甲基脂,TLC (MERCK, Silica) 展层。

参考文献:

Minnikin DE, Hutchinson IG, Caldicott AB, Goodfellow M. Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria. J Chromatogr 1980, 188:221-233. (DOI:10.1016/S0021-9673(00)88433-2)


基因组学

基因组注释 (Genome annotation)

分析内容:原核生物基因组高通量测序原始数据的质控、reads拼接/评价、功能预测和功能注释,并形成数据统计报告。